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TaqMan Master Mix

TaqMan Master MixROX free 货号:NH9201

TaqMan Master MixROX plus 货号:NH9212

采用探针法(TaqManMolecular Beacon等)进行Real Time PCR的专用试剂

在进行Real Time PCR?#20445;?#20165;需将扩增体系稀释至并加入相应的模板、引物及探针,即可进行实验,简化操作过程,缩短操作时间,降低污染。


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产品介绍

TaqMan Master Mix是采用探针法(TaqManMolecular Beacon等)进行Real Time PCR的专用试剂。

本制品包含:经化学修饰的Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、经优化后的缓冲液等扩增必需组分(模板、探针与引物除外)

制品中的DNA聚合酶是经化学修饰的Hot StartDNA聚合酶,与精心研制的Real Time PCRBuffer组合使用,可以?#34892;?#25233;制体系中非特异性PCR扩增,大大提高PCR的扩增效率,进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。

产品特点

激活时间短:激活时间降至2min,PCR净时间65 min

特异性强:?#34892;?#25233;制引物二聚体

灵敏度高:低至6拷贝均可扩增

通用性强:300bp长度片段,65%GC含量均可高效扩增

信号更高:更高性噪比,扩增曲线更美观

稳定性强:放置8Ct及特异性无变化

储存条件及?#34892;?#26399;

在使?#20204;?#25512;荐-20℃保存,在使用后推荐4℃保存,避免反复冻融。

-20℃可稳定保存15个月。由于含有ROX?#21058;希?#38656;要避光保存

适用仪器

TaqMan Master Mix中含有特殊的ROX参?#28909;?#26009;,适用于所有类型的荧光定量PCR仪。

推荐反应程序


*1 在扩增高GC含?#31185;问保?#21487;?#23454;?#22686;加变性时间至15-30秒。

*2退火?#30001;?#26102;间,可根据所扩增片段长度及荧光定量PCR仪器做调整。


Q-1. 反应无扩增曲线
a) 确认阳性对照有无扩增:每次实验推荐附带检测试剂,引物/探针及模板性能的阳性对照
b) 反应循环数不够:?#35805;?#35774;置循环数为40-50
c) 信号采集未设置:两部法扩增程序?#35805;?#23558;信号采集设置在退火?#30001;?#38454;段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在?#30001;?#38454;段
d) 引物/探针降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除降解的可能性
e) 模板存在抑制性?#26680;?#33719;得模板中是否存在纯化不彻底情形需排除
f) 模板浓度太低:减少稀释度重复试验,?#35805;?#26410;知浓度的样品先从最高浓度做起
g) 模板降解:重新制备模板,重复试验
h) 操作失误或设备故障?#30418;?#25490;除
i) 未按照说明书条件进行实验:在?#35805;?#24773;况下优选说明书所提供反应条件


Q-2. 扩增曲线不正常

a) 扩增曲线不光滑:信号太弱或扩增效果过低,需提高模板浓度重复
b) 扩增曲线断裂或下滑?#32791;?#26495;浓度过高,减小基线终点重新分析数据或对模板进行稀释重新检测
c) 个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,扩增反应前仔细检查反应管内是否有气泡残留并通过离心方法去除
d) 模板存在抑制性?#26680;?#33719;得模板中存在扩增抑制剂,可能导致曲线异常


Q-3. Ct值过大

a) 扩增效?#23454;停?#20248;化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物或探针
b) 模板浓度低:减少稀释度重复试验,?#35805;?#26410;知浓度的样品先从最高浓度做起
c) 模板降解:重新制备模板,重复试验
d) 模板存在抑制性?#26680;?#33719;得模板中存在扩增抑制剂,可能导致扩增失败,提高模板稀释倍数或者重新制备模板
e) PCR产物太长:?#35805;?#23558;PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内
f) 反应条件不适合:优化退火温度及?#30001;?#26102;间


Q-4. SNP?#20013;?#28857;分布不理想

a) 扩增效?#23454;停?#20248;化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物探针
b) 模板浓度低:减少稀释度重复试验,?#35805;?#26410;知浓度的样品先从最高浓度做起
c) 模板降解:重新制备模板,重复试验
d) 模板存在抑制性?#26680;?#33719;得模板中存在扩增抑制剂,可能导致扩增较差,信号?#31995;停?#25552;高模板稀释倍
e) 探针设计不理想:探针识别能力有限,建议重新设计探针


Q-5. 阴性对照NTC有扩增

a) 反应试剂被污染:更换新批次试剂并在有条件情况下更换实验场地重复试验
b) SG Mix中可能出现引物二聚体扩增:查看溶解曲线并与目的产物溶解曲线对比,如若为二聚体产物且Ct>36可忽略
Q-6. 标?#35760;?#32447;线性关系不理想
a) 加样误差:加大模板稀释倍数,提高加样体积,减少加样误差
b) 标准品稀释不准确:重新稀释标准品并重复实验
c) 扩增效率差:引物扩增效率较差,可优化反应条件或重新设计引物
d) 标准品降解:重新制备标准品,重复试验
e) 标准品使用浓度过高:?#23454;?#38477;低标准品使用浓度,重复实验


Q-7. SG溶解曲线多峰

a) 引物设?#21697;?#29305;异:根据设计原则设计新的引物
b) 反应条件不适合:优化退火温度,增加反应特异性
c) 引物浓度太高:?#23454;?#38477;低引物浓度
d) 模板浓度低:减少稀释度重复试验,高浓度模板下会使特异性变强


Q-8. 实验重复性差

a) 仪器状态不佳:定期校准仪器
b) PCR板材或贴膜均一性差:更换优?#20351;?#24212;商
c) 模板浓度低:减少稀释度重复试验,高浓度模板下会使扩增重复性加强
d) 加样体积存在较大偏差:使用电动连续分液器并仔细操作,同时增大试剂操作体积
e) 试剂混匀不佳:混合试剂要充分混匀并离心后使用


Q-9. 产品稳定性如何

a) 产品-20℃保存?#34892;?#26399;1年,4℃保存?#34892;?#26399;1个月
b) 反复冻融次数不得超过8次

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